本品系用链霉素（STM）偶联蛋白的抗原、链霉素单克隆抗体和酶标记羊抗鼠及其它试剂制成。用于定量、定性检测牛奶、鸡组织、蜂蜜中链霉素的残留量。

【物理性状】试剂盒外观完整，内装试剂齐全。包被抗原的酶联板透明干燥且用真空包装，链霉素（STM）抗体工作液、底物液、终止液、标准品、浓缩洗涤液、浓缩复溶液为透明液体，酶标记物为浅黄色溶液。试剂无菌检验均应合格。

【灵敏度测定】  取已包被好的酶标板12孔，每两孔分别加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L标准溶液各50µL，再加入STM抗体50µL，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干，加入100µL酶标二抗，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50µL，避光37℃反应15min，用50µL终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值（B）平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）的平均值再乘以100％，即百分吸光度值。以STM浓度（µg/L）的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。

IC50（即0浓度标准溶液的吸光度值50％处所对应的STM浓度）范围应在2.67µg/L ~3.59µg/L之间。

【特异性测定】  取已包被好的酶标板18孔，每两孔分别加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L标准溶液和阴性牛奶样品、50µg/L和100µg/L 两个浓度STM添加的阳性牛奶样本各50µL，再加入STM抗体50µL，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干，加入100µL酶标二抗，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液（A液、B液）各50µL，避光37℃反应15min，用50µL终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值（B）平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以STM浓度（µg/L）的自然对数为X轴，百分吸光度为Y轴，绘制标准曲线图。从标准曲线中查出阴性样品和50µg/L和100µg/L 两个浓度STM添加的牛奶样品的测定浓度。

阴性样品测定值均应在25µg/L以下，50µg/L 和100µg/L两个浓度 STM添加浓度回收率应在55.0％~120.0％之间。

      【精密度测定】  取已包被好的酶标板32孔，每两孔分别加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L标准溶液50µL，其它20孔加入4.5µg/L的标准溶液50µL，再加入STM抗体50µL，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干，加入100µL酶标二抗，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液（A液、B液）各50µL，避光37℃反应15min，用50µL终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。

20个微孔的4.5µg/L标准溶液的吸光度值变异系数（%）应≤25%（n=20）

【适用范围】用于定量、定性检测牛奶、鸡组织（肌肉、肝脏等）、蜂蜜中

链霉素的残留量。

【用法和结果判定】

1.  溶液的配制

1.1 PBST缓冲液的配制：

5.2g  Na2HPO4·12H2O      0.88g  NaH2PO4·2H2O

9g NaCl;  1mL Tween-20   加去离水1000mL溶解

1.2 稀释复溶液：将5X浓缩复溶液摇匀，用去离子水以1：5的比例稀释，临用前配制。

1.3 稀释洗涤液：将20X浓缩洗涤液摇匀，用去离子水以1：20的比例稀释，临用前配制。

2.  样本前处理

2.1  牛奶样本处理方法

取新鲜牛奶样本1.0mL，10℃，3000g以上离心10 min，去除上层飘浮的脂肪层，取下层20µL用样本复溶液780µL将其稀释40倍，混匀后取出50µL即可进行分析。

2.2  鸡肉样本处理方法

2.2.1  2.0g去除脂肪的粉碎样品与8mLPBST缓冲液混合5min，加入正己烷5mL充分混合10min静置1h；

2.2.2  室温3000g离心15min；

2.2.3  用移液器取中间层1mL，加入1mL正己烷，充分振荡5min，3000g离心15min；

2.2.4  去除上层，取下层液50µL，加入450µL复溶液；

2.2.5  取50µL水相进行分析。

2.3   鸡肝脏样本处理方法

2.3.1  5.0g去除脂肪的粉碎样品与20mLPBST缓冲液混合30min；

2.3.2  室温3000g离心10min；　

2.3.3  取2mL上清与3mL正己烷混合振荡5min；

2.3.4  室温3000g离心10min；

2.3.5  去除上层脂肪层，取100µL下层液，加入900µL复溶液；

2.3.6  取50µL水相进行分析。

2.4   蜂蜜产品样本处理方法

2.4.1配制提取缓冲液：1g庚烷-磺酸钠盐，1.5g  Na2HPO4-12H2O，加入蒸馏水至100mL,用磷酸调PH 2.0。

2.4.2  处理程序：称量1.0g样品加入10mL提取缓冲液，振荡10min使完全溶解，室温3000g以上，离心10min，直至清亮。

2.4.3   用RIDA C18柱（纯化提取物）

2.4.3.1  用2mL无水甲醇洗柱子。

2.4.3.2  用2mL水洗柱子。

2.4.3.3  上样，取2mL样本以流速为15滴/分钟过柱。

2.4.3.4  用3mL水洗柱子。

2.4.3.5  用氮气或空气吹干柱子。

2.4.3.6  用1mL无水甲醇洗脱样品，流速为15滴/min。

2.4.3.7  在40~50℃,弱空气或氮气流下完全蒸发溶剂。

2.4.3.8  用4mL PBST缓冲液溶解干燥的残留物，取50µL进行分析。

3.  检测步骤

3.1 将试剂盒从4℃冷藏环境中取出，将所需试剂从盒中取出，置室温（20~24℃）平衡30 min以上，每种液体试剂使用前均须摇匀。

3.2 取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2~8℃，不要冷冻。

3.3 编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔。

3.4 反应：往酶标板微孔中加标准溶液或试样溶液50µL，然后加入链霉素单克隆抗体工作液50 µL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min。倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入250µL洗涤液，30秒后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。加入酶标记物100µL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min。取出酶标板，如前述洗板5次。

3.5 显色：每孔加入A、B底物液各50µL，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min。

3.6 测定：每孔加入终止液50µL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定每孔吸光度值（OD值）。

4.  结果判定

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）的吸光度值再乘以100%，即百分吸光度值。

以STM浓度（µg/L）的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度（µg/L）可以从标准曲线上读出，再乘上稀释倍数。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。

【贮藏条件和保存期】试剂盒应在2~8℃保存，保存期为6个月。

【规格】  每个试剂盒含96孔板一块，STM标准液6瓶 1mL/瓶（0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、 40.5µg/L），STM抗体工作液1瓶，7mL；酶标二抗工作液1瓶，12mL；20X浓缩洗涤液1瓶， 40mL；50X浓缩复溶液1瓶，50 mL；底物液7mL各一瓶；终止液7mL/瓶；高浓度标准品（1µg/ mL）1瓶，1mL；盖板膜1张，自封袋1个；说明书1份；质量报告1份。

【注意事项】

1、试剂盒在缓冲液配制和液体分装上要做到无菌，防止试剂变质。

2、试剂盒标准品应经过严格配制后方可用于试剂盒中。

3、添加回收用的高浓度标准品需经过试剂盒自身标准验证，合格后方可用于特异性和准确度监控用。

4、格按照质量标准所述用法和结果判定内容进行试剂盒质量控制。

5、在试剂盒老化实验中出现有不合格现象，则视该批试剂盒为不合格。