饲料酶的分析

   日期:2019-10-10     来源:互联网    作者:admin    浏览:1    评论:0    
核心提示:读作者:蔡青和 孙… 文章来源:中国农业大学动物科技学院 北京京牧动物营养中心 中牧股份饲料公司、很久以前,人们就利用酶能够

作者:蔡青和 孙… 文章来源:中国农业大学动物科技学院 北京京牧动物营养中心 中牧股份饲料公司、


很久以前,人们就利用酶能够催化生物反应的特性,如酿酒、面包和抗生素合成。酶制剂在纺织、皮革、食品和饮料工业中得到了广泛的应用。饲料酶是工业酶应用的一个方面,饲料酶的使用已经有50多年的历史,但对酶的作用机制的了解只是在最近的10~15年时间。饲料中添加酶最普遍的领域是肉仔鸡的饲料中。其他的领域如猪饲料也涉及。饲料工业中所使用的酶最主要是木聚糖酶,β-葡聚糖酶和植酸酶。其他酶(α-淀粉酶,α-半乳糖苷酶,纤维二糖酶,纤维素酶,果胶酶,脂肪酶和蛋白酶)使用较少。
1. 酶的催化特性
酶是一种特殊的蛋白质分子,能够加快或催化生物细胞之间的化学反应。如果没有酶,生命体中的大部分生物化学反应将变得太慢,以致于不能满足生命活动的需要。酶不同于无机催化剂(如铂)有两个方面,在酶分子中特定的氨基酸顺序(是酶分子完成催化反应所必需)和酶分子作用于特定反应的特定底物。相反,非生物催化剂可能催化许多生物反应。
从生物化学的角度来讲,酶是对于特定底物具有活性的一种物质。工业酶(包括饲料酶)的主要来源是通过微生物发酵和提取过程获得的。虽然有些酶是通过植物和动物组织来提取的,但是发酵正在越来越取代这些过程,因为它们高的生产效率和对环境的负作用小。
2. 酶在饲料中的作用
饲料中添加酶的作用是提高饲料中营养物质在动物肠道中的消化率。
大麦的能值低于玉米的15%,添加葡聚糖酶后,提高了大麦日粮的表观消化能,与玉米和小麦的能值相当。添加酶能够降低常用饲料原料的用量,从而促进对农副产品的利用。植酸酶添加可以降低无机磷的使用。并提高了蛋白质和其他矿物质的利用率。与其他酶合用可以降低粪的排出10~15%。
饲料中存在许多动物不能利用的营养物质。如表1中列出了饲料原料中的NSp含量,可以看出,小麦、黑麦和黑小麦的阿拉伯木聚糖较高,燕麦和大麦中的β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖较高,再就是植物性蛋白质饲料中的α-半乳糖苷和果胶含量高。大豆和其他豆科植物中含有大量的不被小肠消化的多糖。在成年动物,这些物质被大肠中的微生物发酵,但是其中产生的50%的能量不能被利用。另外,生长猪发酵这些物质会伴随皮屑的脱落。
非淀粉多糖酶,其主要作用是降解植物蛋白饲料和谷物饲料中的多糖物质。某些NSps会引起肠道内容物黏度的增加,并阻碍可消化淀粉、脂肪和蛋白质等物质与内源消化酶的接触,引起这些物质消化率的下降。多糖类物质通常在小肠中是不能被消化的,因此不能给单胃动物提供能量。
添加β-葡聚糖酶可以降低以大麦为基础日粮中时产生的黏度。同时β-葡聚糖被降解成单糖被小肠吸收,给动物提供部分能量。同时,淀粉、蛋白质和脂肪的消化率也提高。一般说来,类似大麦的谷物原料,通过添加饲料酶,ME能够提高6~12%。
植酸磷是所有谷物和植物性蛋白质饲料中磷的一种贮存形式,不能被单胃动物利用。如果植酸磷被排到环境中,环境中微生物利用这些植酸磷后,磷就被释放到环境中,成为污染源。植酸酶能够作用于植酸磷,减少饲料中无机磷的添加。另外,植酸酶能够提高蛋白质利用率,降低粪中氮的排出。
表1:饲料原料中NSp含量(g/100g 干物质)

原料

β-葡聚糖

阿拉伯木聚糖

棉子糖

水苏糖

果胶

小麦
大麦
高粱
大豆
菜籽
豌豆

0.7
4.4
0.4
0
0
0

6.6
5.7
2.6
3.6
2.8
2.7

0
0
0
0.3
0.1
0.2

0
0
0
3.6
2.3
1.9

0
0
0.2
9.3
11.2
4.9

3. 饲料酶的活性分析
饲料酶的活性分析方法可以通过体内评定法和体外测定法进行。除了体内法以外,采用其他测定方法比较不同酶制剂产品的质量是很困难的。这是因为不同的饲料酶是不同的微生物通过发酵过程产生的,酶产品中含有的酶活性差别较大。并且各种微生物所分泌的酶的最佳pH、温度和对底物的亲和性都不相同。因此,要想找到一种能够测定同一类型的不同品种的酶(具有不同的pH)活性的方法是不可能的。所以用体外法还不能评价酶在体内的作用效果。
为了保证所生产的酶的活性稳定和保障用户的利益,不同的生产厂家制定了各自的测定酶活的方法。这些方法都是用来测定饲料添加剂、预混料和全价料中酶的活性。目前测定饲料中酶活的方法主要有:
1)还原糖法(Reducing sugar release)
这种方法是采用化学合成或从自然界提取的酶的底物来进行的。酶与底物在特定的条件(温度、pH和底物浓度)下反应。反应产物是还原糖,通过比色确定还原糖的数量,同时制作标准曲线。酶的活性表示为每分钟产生1mmol的产物所需要的酶的量(mg或ml)。
2)比色法(Colorimetric assays I)
这种方法是对底物进行化学修饰,使其带有特定的可溶性生色基团物质,该生色基团能够产生特定颜色。在酶与底物的发生反应后,生色基团就被释放出来,用分光光度计可以测定颜色的深度,并制作标准曲线。与已知标准酶的活性进行比较,计算出该酶的活性。这种方法并不能区分内切和外切酶,但是通常认为这种方法更适合于测定外切酶。目前采用这种方法测定所需的底物被工业上广泛采用。
3)比色法(Colorimetric assays II)
这种方法是通过生色基团结合酶作用底物分子的中间产物(sub-unit)来确定酶的活性。如pNpG(para nitro phenyl),该种物质与半乳糖结合形成一种乳糖(或葡萄糖)类似物。在酶的作用下,释放出pNp,利用其他方法测定pNp的含量。
上述的方法通常只在生物化学实验室采用,饲料酶作用的底物是高分子量的物质,不宜采用。
4)黏度法(Viscometric assays)
这种方法是根据酶能够降低一定浓度的标准底物(控制pH,温度等条件)的黏度的能力来确定酶的活性。利用的底物主要有化学合成的底物(如CMC用于纤维素酶的测定)和自然提取的底物(如小麦阿拉伯木聚糖用于木聚糖酶的测定)。测定的酶的活性值是通过与同时测定的标准酶的活性的比较,来确定酶的活性。
这种方法的特点是通过降低底物的黏度来反应酶的活性,这也正是酶在体内起作用的重要特征。化学合成的底物的效果要优于自然提取的底物, 因为化学合成的底物不利于酶的接触。
5)免疫学法(Immunological methods)
用于酶活性分析的免疫学法包括ELISA法和免疫凝胶扩散法。这两种方法的是根据酶与抗体之间发生反应,然后ELISA法通过第二步反应,凝胶扩散法则通过印染(staining)过程来确定酶的活性(与标准添加酶的水平对比)。
这些方法是非常灵敏的,能够检测到极低水平的酶蛋白。但它们的缺点是对于每个产品的酶需要特殊的抗体,另外作为抗体能够与非酶蛋白质发生反应。由于抗体本身所用的蛋白质是特定的,因此,由不同生产者生产的同种类型的酶之间是没有交叉性的。另外,采用实验动物的敏感性也值得探讨。
6)凝胶扩散法(Gel Diffusion methods)
这种方法是将酶作用的底物与某种凝胶混合后倒入培养皿中,凝固之后,在凝胶上切开一条凿,倒入标准酶液和测试酶液。培养一定时间后,在切开的凝胶周围能够看到水解区域,区域的大小与酶的含量成比例。在某些情况下,还可以再加入其他试剂来显示水解的区域。
这种方法虽然简单,但培养时间长,一般需要一个晚上。因为这种方法是根据区域的大小来确定酶的活性,所以其准确性要低于其他非扩散的方法。但它们的优点在于简单、易操作,不需要复杂的装置,这对于饲料厂来说是适用的。
4. 饲料中酶分析存在的问题
综上所述,上述方法都可以用来检测饲料中酶的活性。但在对饲料酶活性的分析方法中,需要对以下几个方面进行深入的研究:
1. 饲料酶是由各种微生物产生的,具有各自不同的特性(如底物的亲和性,最佳温度和pH)。为了检测某种酶的活性,需要找到一种酶的分析方法,该方法能够测定不同来源的该种酶的活性,但需要对测定条件进行修改。
2. 饲料中酶活性的检测方法没有被普遍接受的一个重要原因就是从饲料中提取酶的方法没有统一,即不能确定从饲料中提取的酶全部是活性酶蛋白质还是部分与饲料结合。研究表明,纤维素酶能够与饲料结合,而其他酶与饲料结合的可能性要低一些。
3. 饲料酶和其他工业用酶制剂一样,并不是单一的酶。在分析饲料中某种酶的活性时,如何消除其他酶对测定结果的影响,尤其是测定方法比较接近的两种酶,(如同采用还原糖方法测定纤维素酶和木聚糖酶)仍然需要进一步探讨。
4. 酶活性的体外分析法并不能用来评价酶在体内的作用。酶活的分析方法主要是用于产品质量的控制,说明目前使用的产品的质量情况。应该在酶的体外评定法和体内法之间建立某种联系,以便能够通过体外的方法来预测酶在体内发挥的作用。但到目前为止,酶产品中,还没有一个酶的生产和销售厂家能够提出一种预测酶在体内的功能的方法。
表2:国外酶制剂公司饲料酶产品的分析方法列表

分析酶名称

分析方法

公司名称

饲料中β-葡聚糖酶

凝胶扩散(Gel diffusion)
比色法(Coloregenic I)
比色法(Coloregenic I)

Altech
Finn Feeds International
Novo Nordisk

饲料中纤维素酶

凝胶扩散(Gel diffusion)

Altech

饲料中木聚糖酶

比色法(Coloregenic I)
比色法(Coloregenic I)

Finn Feeds International
Novo Nordisk

α-淀粉酶

比色法(Coloregenic I)
比色法(Coloregenic I)

Finn Feeds International
Novo Nordisk

β-葡聚糖酶

比色法(Coloregenic I)黏度法(Viscometric)
还原糖法(Reducing sugar)
比色法(Coloregenic I)黏度法(Viscometric)

Finn Feeds International
Novo Nordisk
Rhone poulenc

木聚糖酶

还原糖法(Reducing sugar)
比色法(Coloregenic I)
比色法(Coloregenic I)黏度法(Viscometric)

Finn Feeds International
Novo Nordisk
Rhone poulenc

蛋白酶

比色法(Coloregenic II)
比色法(Coloregenic II)

Finn Feeds International
Novo Nordisk

植酸酶

比色法(Coloregenic II)

Novo Nordisk

 
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