饲料卵磷脂对施氏鲟血清卵黄蛋白原、卵径及性类固醇激素水平的影响

   日期:2019-12-03     来源:互联网    作者:admin    浏览:3    评论:0    
核心提示:饲料卵磷脂对施氏鲟血清卵黄蛋白原、卵径及性类固醇激素水平的影响 张颖1,孙慧武2,徐伟1,孙大江1,曲秋芝1,刘晓勇2,张永旺2

饲料卵磷脂对施氏鲟血清卵黄蛋白原、卵径及性类固醇激素水平的影响
张颖1,孙慧武2,徐伟1,孙大江1,曲秋芝1,刘晓勇2,张永旺2
(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,黑龙江哈尔滨150070;2.中国水产科学研究院鲟鱼繁育技术工程中心,北京100141)摘要:采用不同大豆卵磷脂添加量[0、1%、2%、4%(w/w饲料)]的4种人工配合饲料(分别简称SL0、SL1、SL2和SL4)投喂5+龄施氏鲟(Acipenserschrenckii)后备亲鱼14个月,通过比较各饲料组实验鱼的血清卵黄蛋白原(Vg)、卵径和性类固醇激素水平,探讨大豆卵磷脂对施氏鲟性腺发育的影响机理,并为今后深入研究鲟亲鱼磷脂营养代谢提供基础数据。结果表明,饲料中大豆卵磷脂含量对施氏鲟的卵径发育无显著影响,对血清中Vg、睾酮(T)和雌二醇(E2)的浓度影响显著。投喂量为2%组的血清E2质量浓度(147.91pg·mL-1)显著高于0%(113.72pg·mL-1)和1%(129.63pg·mL-1)组(p<0.05),而4%组的血清E2质量浓度为139.68pg·mL-1,介于二者之间。随着投喂时间和投喂浓度的增长,施氏鲟后备亲鱼的血清T含量浓度降低,而血清Vg浓度随日粮卵磷脂的添加水平和时间增加而升高。结果提示:①施氏鲟卵黄发生期后备亲鱼饲料卵磷脂的适宜添加量为2%,不足或过量对后备亲鱼的生殖机能均有不利影响;②通过影响血清T的产生从而影响施氏鲟的生殖可能是饲料中卵磷脂在施氏鲟生殖机制中的作用之一;③在施氏鲟后备亲鱼强化培育中可通过适当添加卵磷脂的量,从而实现性腺的正常发育,进而改善性腺发育状况、提高施氏鲟的繁殖性能。[中国水产科学,2010,17(4):783-790]
关键词:施氏鲟;后备亲鱼;卵磷脂;卵径;Vg;E2;T
中图分类号:S9  文献标识码:A  文章编号:1005-8737-(2010)04-0783-08
随着20世纪90年代鲟鱼规模化人工繁殖和养殖在中国获得成功,短短的十几年内中国鲟鱼养殖业从无到有,2007年中国已一跃成为世界养鲟大国,鲟鱼年产量为11269t,占世界鲟鱼产量的70%(FAO,2007)[1-2]。鲟鱼养殖业的迅猛发展,极大地推动了鲟鱼配合饲料的研发与应用。但目前尚缺乏大多数鲟类的营养数据,研究较多的种类为白鲟(Acipensertransmontanus)和西伯利亚鲟(A.baerii),而鲟亲鱼因其体型大、寿命长和性成熟晚等特点使得有关对其日粮的研究甚少[3-4]。而亲鱼群体的营养状态极大地影响性腺的成熟、繁殖性能、卵和苗种的质量。因此,鲟亲鱼营养需要的研究可以极大地改善繁殖性能和苗种质量,推动鲟鱼产业化发展[5]。卵磷脂(phospholipid)作为重要的营养素,可以有效地改善水产动物如真鲷(Chrysophrysmajor)[6]、墨吉对虾(penaeusmerguiensis)[7]、罗氏沼虾(Macrobrachiurosenbergii)[8]、中华绒螯蟹(Eriocheirsinens)[9]、花尾胡椒鲷(plectorhynchuscinctus)[10-12]、海鲈(Dicentrarchuslabrax)[13-14]等幼鱼的生长、成活率、机体脂肪的组成、免疫功能、抗脂肪肝和抗应激等生理机能,而有关不同日粮卵磷脂水平对亲鱼繁殖性能的影响研究报道甚少,有关鲟亲鱼的日粮卵磷脂需要的研究则更少。施氏鲟(Acipenserschrenckii)作为中国本土重要的鲟鱼养殖种类,具有生长速度快,抗病力强等优点,深受养殖户的欢迎。本研究以大豆卵磷脂0%、1%、2%和4%4种人工配合饵料饲养5+龄施氏鲟后备亲鱼14个月,

研究大豆卵磷脂对后备亲鱼血清中血清卵黄蛋白原(Vg)、雌二醇(E2)和睾酮(T)的含量和卵径的影响,探讨饲料卵磷脂含量影响施氏鲟生殖性能的机制,以期为后备鲟鱼配合饲料生产提供指导,并为今后深入研究鲟亲鱼磷脂营养代谢提供基础资料。
1·材料与方法
1.1实验鱼
施氏鲟后备亲鱼取自中国水产科学研究院北京房山鲟鱼繁育中心,人工繁殖5+龄后备亲鱼,体质量5~6kg。
1.2饲料配方
以鱼粉为蛋白源,精制鱼油为脂肪源,配制粗蛋白46%,粗脂肪19%,水分10%,粗纤维1.7%,磷1.5%,灰分10.8%的基础饲料,填加卵磷脂(来源于北京美亚斯磷脂技术有限公司)的量分别为0、1%、2%和4%的颗粒状配合饲料4种(表1)。卵磷脂的添加水平,参照Meyers[15]的方法。
1.3实验设计
将后备亲鱼均以手术的方法检查雌雄,挑选雌性性腺发育处于Ⅱ期末的施氏鲟,分为4组,每组3尾(体质量见表2),设置1个对照组,分别以SL0、SL1、SL2和SL4(表1)4种饲料喂养,每天投喂量为初始鱼体质量的1%。本实验起始于2007年8月,于2007年10月和2008年10月对实验组后备亲鱼各取血1次。取血前,先将亲鱼捞入含丁香油的淡水中麻醉,然后用注射器从尾动(静)脉取血。血样先注入置于碎冰中的1.5mL塑料离心管内,室温放置1h后,5000r/min离心10min,血浆入液氮中速冻后再置-20℃冰箱中保存,待测l7β-雌二醇(17β-estradiol,E2)和睾酮(Testosterone,T)含量。



1.4卵巢的观察和卵径的测量
卵巢的观察和卵径的测量实验分别于2007年8月、2007年10月和2008年10月进行了3次采样,利用丁香油将鱼体麻醉后,测量实验鱼初始体质量,然后手术取性腺,用Bouin氏液固定,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石腊包埋,切片厚度为4~8μm,苏木素-伊红染色,显微镜下观察卵巢的发育,施氏鲟卵巢发育分期依据曲秋芝等[16]的方法。卵径测量,腹部解剖后取小块卵巢组织解剖镜测量卵径。
1.5血清中E2和T浓度的测定
于哈尔滨市黑龙江中医药大学放免室采用北京北方生物技术研究所的E2和T放射免疫试剂盒测定血清中的E2和T含量。E2和T的最低可测量值(90%特异性结合率时的计算值)分别为5pg/mL和0.1ng/mL,批内变异系数分别为7.8%(80pg/mL,n=6)和6.5%(2ng/mL,n=6)。
1.6血清中Vg浓度的测定
采用异种双抗夹心ELISA测定血清Vg含量,操作步骤如下:1)包被:用一定浓度的豚鼠抗Lv血清(本实验室自制)包被酶标板(每孔100μL),4℃过夜。2)洗涤:弃去包被液,用pBST洗涤3次,每次2min。3)封闭:加入1%BSA室温封闭1h(每孔100μL)后洗涤3次。抗原抗体反应:加入一定浓度的待检血清(每孔100μL),37℃孵育30min,洗涤3次。加入提纯的羊抗Lv血清:加入一定浓度的羊抗Lv血清(每孔100μL),37℃孵育30min,洗涤3次。抗原抗体复合物与酶标抗体反应:加入一定浓度的兔抗羊IgG-HRp(每孔100μL),37℃孵育30min,洗涤3次。显色:加入OpD底物显色液(每孔100μL),室温避光静置15min。终止反应:在每个孔中加入50μL终止液(2mol/LH2SO4)。于492nm波长下测定各孔的OD值。
建立标准曲线:设标准孔8孔,每孔中各加pH9.6碳酸盐缓冲液100μL,将纯化Vg用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释成16~256

ng/mL包被,其他步骤同上。采用标准曲线,计算各检测血清浓度。
1.7数据的统计分析
对数据的统计分析用SpSS10.0进行。对数据进行了单因子方差分析,对不同数据间进行了DUNCAN多重比较,结果以平均值±标准差表示,以p<0.05作为差异显著的标准。
2·结果与分析
2.1饲料中卵磷脂含量对后备亲鱼血清E2浓度的影响
经过14个月的饲养,后备亲鱼血清E2质量浓度从96.08pg/mL升高到132.75pg/mL,卵磷脂投喂量为2%组的血清E2质量浓度(147.91pg/mL)显著高于0组(113.72pg/mL)和1%组(129.63pg/mL)(p<0.05),而4%组的血清E2质量浓度为139.68pg/mL,介于二者之间(图1)。

2.2饲料中卵磷脂含量对后备亲鱼血清中T浓度变化的影响
随着投喂时间和投喂水平饲喂卵磷脂的增长,施氏鲟后备亲鱼的血清T含量浓度受到抑制。其中,4%和2%添加组的血清T含量分别由32.09ng·mL-1显著降低到18.12ng/mL和35.43ng/mL降低到21.1ng/mL(p<0.05),而0%组和1%组血清T浓度未受到明显抑制(p>0.05)(图2)。可见,施氏鲟后备亲鱼血清中T含量与卵磷脂投喂水平和投喂时间变化有关。

2.3饲料中卵磷脂与后备亲鱼血清Vg含量和卵巢发育间的变化关系
由图2可见,后备亲鱼血清Vg浓度随日粮卵磷脂的添加浓度和时间增加而升高,而各实验组的血清Vg浓度均显著高于对照组。后备亲鱼的卵径随卵巢发育而增大,各饲料组间卵径无显著差异(p>0.05)(表2)。切片观察,Ⅱ期卵巢组织内有大量的脂肪(图版Ⅰ-1),占卵巢整体的大部分,卵巢内的生殖细胞是以第2时相的初级卵母细胞小生长期的细胞为主,细胞呈多角圆形(图版Ⅰ-1),部分细胞质可见到网状结构。初级卵母细胞外有滤泡膜(图版Ⅰ-2)。Ⅲ期初卵巢卵母细胞质占细胞体积的大部分,嗜碱性减弱,细胞质有颗粒物质并形成环层,脂肪滴出现在核的外周(图版Ⅰ-3),表明血清Vg转运大量的脂肪和钙离子进入卵巢,是施氏鲟主要营养素储存和转运的物质形式。


3·讨论
众所周知,亲鱼营养对提高鱼类的生殖性能、卵子质量和仔稚鱼生长与存活等具有重要的作用[17]。有关其营养需要的研究甚少。后备5+鲟亲鱼体长已超过100cm、而性腺发育却只达到Ⅱ期末,研究周期长、研究成本高也是限制鲟亲鱼营养研究的另一个重要因素。目前,有关鱼类日粮添加磷脂的研究多集中如金鱼(Carassiusauratus)[18]、鲤(Cyprinuscarpio)[19]、真鲷[6]、日本牙鲆(paralichthysolivaceus)[20]和虹鳟[21]等仔稚鱼的生长和成活率等方面。有关亲鱼日粮添加大豆卵磷脂对其繁殖性能等方面的影响的研究内容甚少[4],在鲟方面还未见报道,究其原因,可能与鲟亲鱼体形庞大、寿命期长、性成熟晚、亲本样本少等因素有关。在甲壳类中相关报道较多,如Sui等[22]的研究表明,饲料中添加3.6%的大豆卵磷脂可有效地改善中华绒螯蟹成熟雌蟹的繁殖性能。本研究中,添加2%的大豆卵磷脂可以提高施氏鲟后备亲鱼血清E2和Vg浓度,从而改善施氏鲟亲鱼的繁殖性能。这一结果与对虾亲体饲料中卵磷脂水平应该高于2%,以确保其卵子发育50%脂肪的需要的结果相同[7],高于鲑科亲鱼1%的需要量[23-24],说明当饲料中磷脂含量超过仔稚鱼虾需要量时,鱼和虾的生长发育不受其影响[6,25]。本研究中卵磷脂的添加量对卵径无显著影响,而4%的添加量明显的抑制后备亲鱼血清T浓度。由于本实验采用的是后备亲鱼,对

其生殖性能的影响还需要进一步的研究。本实验中Vg浓度随日粮中卵磷脂添加量的增高而增加,作为磷脂的转运蛋白,协同增加,因此在后备亲鱼进入快速发育期,应增加饲料中磷脂的含量,使卵内磷脂储备增加,加速卵黄发生期卵母细胞的生长方面,可为胚胎发育提供营养[26]。血浆性类固醇激素水平是由其在性腺等组织中的产生速度及其在血液和组织中的代谢速度等因素决定的[27]。本实验中,血清Vg浓度随着E2的升高和T水平的降低而升高,这可能是E2在芳香化酶的作用下由T转变而来的,T和E2具有底物与产物的关系有关,从而高浓度的E2诱导肝脏产生高浓度的Vg[27-28]。李远友等[29]的研究表明,n-3HUFA对花尾胡椒鲷性腺类固醇激素产生的抑制作用可能是其影响血浆性类固醇激素水平的机制之一。本研究中,饲料中高浓度的卵磷脂水平抑制血清T含量,提高了血清中E2和Vg的含量,这可能是与饲料中卵磷脂代谢水平的提高,需要更多脂类转运蛋白(Vg),而Vg的产生需要调节机体的E2水平,调节了鱼体的“脑→脑垂体→性腺”功能轴,对鱼体的内分泌系统的功能产生影响的结果[30]。
参考文献:略

 
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