白腐真菌及其木质素酶的研究进展

   日期:2020-01-14     来源:互联网    作者:admin    浏览:6    评论:0    
核心提示:刘玲叶博刘长江白腐真菌是一种作用于木质类结构,专门用于降解木质素、纤维素、半纤维等多糖类物质的真菌,在现代轻工业中的作用
刘玲叶博刘长江
白腐真菌是一种作用于木质类结构,专门用于降解木质素、纤维素、半纤维等多糖类物质的真菌,在现代轻工业中的作用非常重要。近年来关于白腐真菌的研究逐渐增多,主要集中在3个方面:①白腐真菌的发酵培养;②白腐真菌降解的机理;③白腐真菌酶的研究。
1白腐真菌的作用
木质素是植物的重要组成成分之一,它是填充在细胞间和细胞壁的结构成分,占细胞结构的15%~30%。秸秆中的非水溶性木质纤维素很难被酸和酶水解,主要是因为纤维素的结晶度、聚合度以及环绕着纤维素与半纤维素缔合的木质素鞘所致。木质素与半纤维素以共价键形式结合,将纤维素分子包埋在其中,形成一种天然屏障,使酶不易与纤维素分子接触,而木质素的非水溶性和化学结构的复杂性,导致了秸秆的难降解性。要彻底降解纤维素,必须首先解决木质素的降解问题。白腐真菌能够降解木质素,也能够降解纤维结构,但降解木质素的能力优于其降解纤维素的能力,它能分泌胞外氧化酶,使木材中的木质素发生降解且不产生色素,被认为是主要的木质素降解微生物。
目前我国对白腐真菌作用的研究集中在降解木质素上,除了这个主要的作用之外,白腐真菌还有很多工业用途,如在造纸工业、食品工业、生物肥料等方面都有着微生物特有的降解功能,日渐引起关注。
2白腐真菌降解机理的研究
白腐真菌所具有的降解木质素和纤维素、脱色和制浆能力都源于白腐真菌所产生的酶系统。20世纪80年代末开始,研究降解木质素酶类的重点集中在有分解能力的菌种的产酶能力和酶学特性上。同样是以担子菌为主,尤其是以黄孢原毛平革菌为对象,但进一步研究的是真菌分解木质素的机理。真菌分解木质素是依靠一个复杂的胞外过氧化物酶系统,这一系统主要由3种酶构成:木质素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)、漆酶(Lac),另外还有其它几种酶的综合作用。总的来说,这些酶的作用机理是:在适宜的条件下,白腐真菌的菌丝首先利用其分泌的超纤维素酶溶解表面的蜡质,然后菌丝进入秸秆内部,产生纤维素酶、半纤维素酶、内切聚糖酶、外切聚糖酶,降解秸秆中的木质素和纤维素,使其成为含有酶的糖类。2.1木质素过氧化物酶及其理化性质
木质素过氧化物酶(Lip)是一系列含有一个Fe(S)-卟啉环(IX)血红素辅基的同功酶,分子量37000~47000,等电点为3.5左右。Kirk等人在1983年从限氮培养黄孢原毛平革菌时发现了过氧化物同工酶,在这些同工酶中,H1、H2、H6、H7、H8和H10是木质素过氧化物酶,其中H2和H8的数量占优。木质素过氧化物酶在温度大于35℃时开始失活,pH值为4.5时很稳定,在pH值3.0以下极不稳定,加入藜芦醇可极大地增加酶的稳定性。EDTA、叠氮化物、氰化物和3-氨基-1,2,4-三吡咯都能抑制它的活性,但氯离子不会抑制。无其它还原性底物时,H2O2会引起酶的部分和不可逆失活。Lip的催化机理:高铁酶首先被H2O2氧化生成二价氧化产物——复合物Ⅰ(CompoundⅠ),然后复合物Ⅰ获得一个电子而被还原,得到一价酶中间产物——复合物Ⅱ(CompoundⅡ)和一个自由基产物,复合物Ⅱ能够作用于木质素或其它基质,这个催化反应因为一个电子的还原反应而不断进行下去(见图1)。在有过氧化物存在时,可以继续氧化为复合物Ⅲ(CompoundⅢ),但这不是催化反应的部分。
2.2锰过氧化物酶及其理化性质
锰过氧化物酶(Mnp)是一种糖蛋白,分子量约为46000,由一个铁血红素基和一个Mn2+构成了活性中心,另外还有两个起稳定结构作用的Ca2+,

其分子中有10条长的蛋白质单链,一条短的单链,它是唯一的一个中间过氧化物酶,因为它的主要底物为有机酸。
Kirk等人发现的10种过氧化物酶中H3、H4、H5和H9均是锰过氧化物酶。锰过氧化物酶的活性不仅依赖于H2O2,还依赖于Mn2+的存在。在温度大于40℃时开始失活,它的最佳稳定pH值是4.8,加入“惰性”蛋白质(如牛血清蛋白)和Mn2+可提高酶的稳定性。另外,Mn2+、蛋白质(如凝胶、牛血清蛋白、蛋清蛋白)和α-羟基酸(如苹果酸、柠檬酸)都能促进酶活的提高。锰过氧化物酶催化反应机理是:H2O2的两个电子将高铁酶氧化,形成中间产物——复合物Ⅰ(CompoundⅠ),复合物Ⅰ将Mn2+氧化为Mn3+,酶被还原为一价中间产物——复合物Ⅱ(CompoundⅡ),复合物Ⅱ是锰过氧化物酶非常重要的中间物质,如图2。在过量的过氧化物存在时,酶被氧化为复合物Ⅲ(CompoundⅢ),但同样这不是催化反应的部分。

2.3漆酶及其理化性质
漆酶(Lac)是一种含铜的多酚氧化酶,主要来源于生漆和真菌,分子量为60000~80000,含有15%~20%的碳水化合物、520~550个氨基酸残留物。很多白腐真菌产生的漆酶,它的确切作用机制尚不清楚。但其主要作用是催化氧化还原反应,在植物体内,它催化木质素的聚合过程,使木质素沉积,而真菌产生的漆酶则进行相反的过程,使木质素发生降解。漆酶的作用因不同菌合成的类型不同而不同。漆酶作为一种多酚氧化酶,它可催化氧化酚类或芳胺类等多种底物,同时分子氧被还原为水。在这一过程中,漆酶从底物分子中提取一个电子,使之形成自由基,该自由基不稳定,可进一步发生聚合或解聚反应。
2.4乙二醛氧化酶及其理化性质
乙二醛氧化酶(GOx)是一种胞外氧化酶,它能催化乙二醛、甲基乙二醛等一些简单醛类的氧化,它是胞外酶液中含量较少的酶蛋白。乙二醛氧化酶的pH值活力范围很宽,pH值6.0时呈现出最大活力。Cu2+加入到纯化的乙二醛氧化酶中会显著增加其活力,同时它的活性受木质素过氧化物酶系统的活化,这一点可能具有相当的生理学重要性。木质素过氧化物酶性质中很重要的一点是它在无适合底物时,不管是在胞内还是胞外,都会因H2O2的存在而发生不可逆失活,而对乙二醛氧化酶来说,在无过氧化物酶的底物时,它会可逆地失活以阻止体内高浓度的形成,这样就防止了过氧化物酶的失活。黄孢原毛平革菌的降解活动主要发生在次级代谢阶段,与降解有关的酶只有当一些主要营养物(如氮、碳、硫)限制时才形成。营养限制使黄孢原毛平革菌应答产生了对底物的降解酶系统。图3表示了在白腐真菌反应体系中不同酶所形成H2O2的几种途径,其中以芳基醇氧化酶(AAO)和乙二醛氧化酶(GOx)为主产生H2O2的酶:苄基醇在AAO催化下形成H2O2;乙二醛在GOx氧化下生成H2O2。
3酶活调控与最适培养基
3.1碳源和氮源
在自然条件下,大多数白腐真菌合成的酶量很低。国内外曾利用多种不同有机、无机或复合碳、氮源来研究它们对白腐真菌产酶能力、关键酶系构成及酶活性的影响。结果表明,碳源和氮源是微生物降解木质素和产酶的一个极为重要的影响因素。在报道的某些模型木质素分解菌中,碳、氮源的营养限制可用于刺激木质素降解酶的合成,如黄孢原毛平革菌的木质素降解和木质素降解酶的产生是发生在氮源或其它营养被消耗的次级代谢过程中。比较胞外酶和胞内酶活性发现,同种碳源时,若胞外酶活性较高,其胞内酶活性一般也较高,说明碳源对胞外酶和胞内酶的影响是基本一致的,各碳源对酶类由胞内分泌到胞外的影响差别不大。有研究表明:糊精是最优碳源,D-葡萄糖、纤维

二糖和麸皮浸汁(1%)均有利于木质素过氧化物酶的合成,混合糖源比单独糖源好。氮源的影响情况与碳源基本相同。在氮源中,复杂的有机氮源酵母浸汁和牛肉膏培养基中木质素过氧化物酶酶活最高,而菌丝体的产酶效率以酒石酸铵最好;硝酸铵、硫酸铵、丙烯酰铵和L-谷氨酸也有利于酶的合成。pickard研究了几种稻谷麸皮原料,包括麸皮、麦麸、燕麦麸、松屑等,结果证明以麸皮为碳源产生的酶活最高,此研究对于目前降解秸秆资源具有实际意义。

3.2培养条件
白腐真菌的培养有固态和液态两种。在固体发酵中,培养物的气体交换是影响白腐真菌对秸秆降解作用的重要因素之一,气体交换量是由预混物中固相与液相之比决定的,含水量过高或过低都会阻止白腐真菌的生长。实验表明,最适的固液相之比为3:1。Dosoretz等人考察限氮浸没培养条件下通氧和通空气对两种过氧化物酶合成的影响。他们研究了5种通氧和4种通空气的情况,发现通气条件对酶的合成有很大影响。通空气条件下菌丝不合成木质素过氧化物酶,能合成锰过氧化物酶,但酶活低于通氧条件下的。连续通氧比周期性通氧增加了葡萄糖的消耗,产生较多的蛋白酶和多糖,因此得到的两种过氧化物酶酶活相应较低,酶活越过峰值后下降也越快。大多数白腐真菌适宜生长在微酸性环境内,pH值在4~5之间;而对于耐碱性白腐真菌,最适pH值为7~9。不同菌种适宜的pH值范围不尽相同,但是在实际生产中对于大多数喜微酸性环境的白腐真菌,固体发酵接种时,不必考虑秸秆基料的pH值,因为其可在发酵早期产生大量有机酸,使秸秆从pH值为6左右迅速下降至4.0左右,为后期发酵创造适宜的酸碱环境。除了上述影响因素外,白腐真菌在开始生长时还需要基质处于无菌和高度需氧的环境。在有杂菌存在时,杂菌可能占优势,致使处理失败。
3.3微量元素
白腐真菌对产木质素降解酶有重大影响的微量元素主要是Cu和Mn。Bonnarme等人研究了Mn2+对锰过氧化物酶合成的调节作用,发现在合成Mnp过程中,Mn2+的作用至关重要。Mnp的合成是由Mn2+诱导的,Mn2+的存在增加了MnpmRNA的合成量,提高了Mnp基因的转译,所以培养基中缺乏Mn2+时就不能合成Mnp。Mn2+的浓度在0~40mg/l之间时,浓度越高越有利于Mnp的合成,当Mn2+浓度超过200mg/l时酶活性有所下降。Mn2+对Lip合成的影响比较复杂,Mn2+可以提高Lip的活性,当培养基缺乏Mn2+时,细胞可以合成藜芦醇,它既是合成Lip的诱导物,同时又能保护Lip不因H2O2而失活,由此细胞能够合成一定量的Lip。当培养基中只有微量的Mn2+时,无MnO2形成,同时细胞也不能合成藜芦醇来诱导Lip的合成;而在高浓度Mn2+的条件下,大量的Mn2+在Mnp的作用下被氧化成Mn3+。
Cu2+对于漆酶的产生和酶活性是相当重要的。研究发现,发酵培养基中不添加Cu2+时,漆酶活性极低;添加量在0~5mol/l范围内,酶活水平随Cu2+浓度的增加迅速提高;当大于10mol/l以后,漆酶酶活水平反而降低。说明培养基中适量的Cu2+对菌株漆酶的合成及活性是必不可少的,但过多的Cu2+又抑制菌株漆酶的表达分泌。
3.4诱导物
诱导物的浓度高低对白腐真菌木质素降解酶的合成有着重要的影响。一些诱导物在诱导合成关键酶的同时,还可能起到分散剂、保护剂的作用。有文献报道,一些木质素及其亚结构类似物是木质素降解酶生成的有效诱导剂。有些学者认为,白腐真菌被诱导分泌酶类可能是由于其从培养基质中消除了某些有害芳香物的毒害作用,故可依此用于提高木质素降解酶产量。从已有的研究结果来看,所使用的诱导剂,如吐温80、香豆酸、香草酸、藜芦醇、愈创木酚、儿茶酚等,其作用机理大都是与降解底物有相似结构的化合物,这些化合物既是诱

导底物,又是代谢底物,其降解的同时促进了难降解化合物的降解,此时,代谢底物之间可能发生相互作用,如电子传递等。值得指出的是上述诱导剂的作用机理并非完全相同。如Bar-1ev等的研究表明,静置培养时,吐温80能够提高细胞膜的渗透性,解除已合成的锰过氧化物酶在细胞内对酶基因的转录或mRNA翻译的阻碍,有利于酶的分泌。在利用不同的菌种降解目标化合物时,最佳的诱导剂可能不同。藜芦醇作为Lip的诱导剂有极其重要的作用,它是木质素降解过程中非常重要的次生产物;藜芦醇还可以阻止过量的过氧化氢对Lip的损伤。藜芦醇可以由木质素降解体系内源产生,也可以通过外源投加。H2O2也是一种诱导剂,关于它的作用在酶的机理中已经阐述。不同的诱导物其诱导产生的主要木质素降解酶不同;诱导物对产酶及酶活性的影响也因菌种而异;不同的菌种在不同的环境条件下其产酶所需的最适宜诱导剂及其浓度也可能有较大的差异。
参考文献
1YoshidaS,YoneharaS,MinamiS,etal.productionandcharacterizationofligninolyticenzymesofBjerkanderaadustagrownonwoodmeal/wheatbrancultureandproductionoftheseenzymesusingarotary-solidfermenter[J].Mycoscience,2002(37):417~425
2RaoSK,TienM.Oxidationofguaiacolbyligninperoxidase[J].JournalofBiologyChemical.,1995(270):22254~22258
3VishalShah,FrantisekNerud.Lignindegradingsystemofwhite-rotfungianditsexploitationfordyedecolorization[J].CanadianJournalofMicrobioligy,2002(48):857~570
4A.rdonO,KeremZ,HadarY.Enhancementoflignindegradationandlaccaseactivityinp.leurotusostreatus[J].CanadianJournalofMicrobioligy,1998(44):676~680
5M.A.pickard,H.Vandertol,R.Romand,etal.Highproductionofligninolyticenzymesfromwhiterotfungiincerealbranliquidmedium[J].CanadianJournalofMicrobioligy,1999(45):627~631
6DosoretzCG,ChenAHC,GrethleinHE.Effectofoxygenationconditionsonsubmergedculturesofphanerochaetechrysosporium[J].App1.Microbial,Biotechnol.,1990(34):131~137
7Bonnarmep,JeffriesTW.Mn(Ⅱ)regulationofligninperoxidasesandmanganesedependentperoxidasesfromlignindegradingwhiterotfungi[J].App1.EnvironmentMierobio1ogy,1990,56(1):210~217

 
打赏
 
更多>同类资讯信息
0相关评论

推荐图文
推荐资讯信息
点击排行